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1.將電轉化儀設置為200D(電阻)、25rtF(電容)和2.5kV。
2.在冰上復溶電感受態細菌或使用新鮮制備的電感受態細胞。將電轉化杯、杯固定夾、細胞和DNA均放于冰上。
3.將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。
4.將混合物轉移至0.2cm間距的電轉化杯中,小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯,使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉移以使小杯處于低溫狀態。
5.將透明杯放入電轉化儀內,確保小杯側面干燥(以免電弧)。啟動脈沖,立即加入1.0ml SOC培養基并混合。時間恒定值應在4.5~5.5毫秒范圍之間。如果時間恒定值小于4.3秒,則重復DNA沉淀。
6.在每次電轉化后的細菌中加入lmlSOC培養基,以250r/min振蕩培養,37℃1小時。
7.合并所有電轉化培養液,系列稀釋后在100mm TYE/amp/glu平板上鋪板確定文庫容量。
8.以200g、4℃10分鐘離心剩余的細菌培養液。將每4次電轉化的沉淀重懸于500u1的體積。以每份125ul等量體積分別鋪于150mmTYE/amp/glu平板上或將500ul鋪于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm2。將這些平板在30℃下培養過夜。
9.加入10m1含15%甘油(0.2gm濾膜過濾除菌)的TYE/amp/glu培養基;刮取平板上的細菌。在-70℃下儲存抗體文庫。
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