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1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標準濃度。但有時需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封閉每個板孔，37℃孵育2小時。4．用PBS洗滌板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養基上清，用移液器反復吹吸混勻，室溫孵育1小時。7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次...
噬菌體展示可使抗體親和力提高到1000倍以上。很典型的起始點是自噬菌體抗體文庫中分離特異性抗體。為完成親和力的成熟（親和力的增加），要對抗體序列進行多樣化；突變基因文庫展示在絲狀噬菌體表面上，并在抗原上選擇具有更高親和力的結合性抗體。盡管整個過程已相當清晰，但研究者在進行體外親和力成熟前必須明確：提高特定抗體親和力將會產生預期的生物學效果。當嘗試用抗體中和循環中的毒素或生長因子時，更高的親和力就顯得特別重要。在此情況下，抗體與抗原都分布于同樣的區域，能使抗原抗體的相互作用達到...
利用含有目標受體的復雜混合物，對噬菌體展示肽文庫進行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細胞或組織表面等。在此情況下，目標就是要鑒定出結合于特定受體分子或結合于一組具有特定性質的受體上的多肽。我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關抗體的相應配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來自HCV感染者和非感染者的血清（以下...
實驗過程的zui后步驟是以合成每一個結合性或定位性的多肽來作為熒光標記多肽[典型的熒光素或若丹明（rhodamine）]，然后在靜脈注射后測定其生物分布的。熒光標記也使得多肽能在隨后的沒有任何修飾的受體分離中被使用：可以使用熒光多肽在基于細胞的表達性克隆系統中分類受體陽性的細胞，并且也可以通過高親和性的鼠抗熒光素單抗體的使用把熒光多肽直接固定到固體基質上。在有偶合劑（couplingreagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情況下，加入異硫氰酸熒光素I（f...
1．使用來自篩選出的噬菌粒克隆的模版DNA，以及包含與AP融合表達載體的克隆位點相對應的限制性酶切位點的寡核苷酸引物，進行PCR反應。2．通過瓊脂糖凝膠電泳檢測正確大小的擴增產物。選擇相應方法對PCR產物進行純化。3．用對應于克隆位點的限制性內切酶消化PCR產物，使用標準的方法將此產物連接到相同酶切后的AP融合蛋白表達載體中。4，通過標準的方法將連接產物轉化入大腸桿菌中，鋪到含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。挑取單克隆，利用標準的方法（如限制性酶切或PCR）鑒定是否有...
麥芽糖結合蛋白ELISA的方法與以前論文所述一致[1Sj，除了從大腸桿菌中釋放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我們發現，使用商業性的去垢劑（Pierce公司的B-PER抽提試劑）較溶菌酶能更簡單有效地裂解細菌細胞。3ml培養基中的經誘導的細胞先通過沉降，再通過含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重懸。于室溫下放置20分鐘后，離心5分鐘以除去細胞碎片，將上清轉移到一個新的管中。裂解物于一70~0凍存，當用于ELISA反應時按1：50稀釋。在幾個實驗項目中，我們發現...
1．合成需要的靶標DNA或RNA寡核苷酸，其中一組是5’端連接生物素的寡核苷酸鏈。為dsDNA位點合成一條不聯結生物素的互補副鏈。2．①對于DNA位點的篩選，將每條寡核苷酸鏈各取10u1，與20/A1的2X核酸退火緩沖液混勻，讓兩條互補的寡核苷酸退火。在PCR儀中以94℃加熱樣品3分鐘，然后以每分鐘2℃的速度冷卻至4℃。冷卻后，用水將溶液稀釋至1pmol/L的終濃度，于-20℃保存。②對于RNA位點篩選，用RNA折疊緩沖液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。將溶液加...
A.噬菌體的制備1．挑取含有源自文庫篩選的噬菌體克隆的單菌落。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于滅菌圓底培養板的微孔內，其中加有150ul含15ug/ml的四環素的2×TY培養基。用一個微孔培養展示野生型DNA/RNA結合區域的噬菌體，作為陽性對照。以250r/min的速度小心振蕩微孔板，30℃培養16小時。2．在合適的吊斗式離心機中3700g離心96孔培養板15分鐘，以制備噬菌體上清液。將上清液轉移到一個新的微孔板內，4℃保存。B.噬菌體ELISA1，將生物素聯結的核酸靶標位點（通...
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