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1．通過腹腔注射濃度為1．25％（w/v）的阿佛丁來麻醉小鼠。2．打開胸腔并暴露心臟。3．用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。4．連同一個或多個對照器官一起，取出要研究的器官和組織，并將其置于一個直徑為30m的細胞培養皿中。5．用無菌刀片將每個器官或組織都切碎。6．將切碎的器官或組織放到2．2m1的無菌塑料管中，并加入1．8m10．5mg/m1的膠原酶。混勻并在37℃搖瓶孵育30分鐘。在37℃培養時，持續搖動樣品。7．以1500r/min的速率短暫離心細胞懸液5分鐘，并棄...
pG6質粒是噬菌體顆粒載體，是為融合蛋白的單價展示設計的。來自輔助噬菌體的野生型pⅥ與噬菌體顆粒載體表達的pⅥ-cDNA的融合蛋白競爭合成原始的噬菌體顆粒。在多鏈接區域除了有一個額外的SalI位點以外，實際上噬菌體顆粒載體pG6A、pG6B、pG6C與載體pDONG6是等同的，pDONG6允許在gⅥ的3’末端進行eDNA文庫克隆。從lac啟動子轉錄可以產生雙側順反子mRNA：*條順反子在lacZ和gⅢ3’末端之間編碼一個融合蛋白，而第二條順反子包含了gⅥ-eDNA融合基因。g...
[方法]A.PCR擴增cDNA插入片段1．在冰浴中將以下成分加到0．2m1微量離心管中（執行10步反應）●水，36．5ul●10×Pfu緩沖液，5．0ul●10mmol/LdNTP，1．5ul●λGTll正向引物（10umol/L），2．5ul●λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul●已制備好的Sfi-NotIλGTllcDNA文庫，1．Oul●PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul2．混合反應物并用50ul的礦物油覆蓋。3．在95℃下使模板變性2分鐘，...
[方法]1．收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細胞。2．用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細胞3次。3．在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細胞，并加入7ml裂解緩沖液（可溶解達到5×108個外周血淋巴細胞），然后劇烈渦旋振蕩以溶解細胞。4．加入7體積（49m1）4m01/L氯化鋰，4℃孵育15～20小時（過夜）。5．將懸液轉移到30mlCorex管內，在吊桶式轉頭內4℃離心2小時，6500r/min。6．棄去上清，并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰（大約15m...
[方法]1．為合成cDNA*鏈，在1個1．5ml硅化微量離心管中制備以下反應混合液，●10－RT緩沖液，5ul●20×dNTP，5ul●100mmol/LDTT，5ul●HuIgMFOR引物，2ul●HuCκFOR引物，2ul●HuCλFOR引物，2ul●RNAsin，80U（2ul）●所有引物濃度均為10pmol/ul2．取整數體積（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1個無菌1．5ml微量離心管內，并用微型離心機離心5分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀1次，晾干，并用24．5ul...
[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的載體和scFv文庫●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制兩個100ul連接混合液，其中1個用于VH-VκscFv文庫，另1個用于Vu-VλscFv文庫，并設置兩個對照反應。對照可以確定未切的載體有多少（對照2），以及確定無插入序列時有多少重新連接的載體（對照1）。要保持恰當的比例，所獲得的克隆數（對于相...
[方法]1．將大腸桿菌TG1種到基本培養瓊脂板，37℃過夜。2．將基本培養瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m12XTY培養基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養過夜。3．用5ml夜培養的TGl接種到兩個含500m12×Y培養基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養約1．5小時，直到A600接近0．5。4．將菌液轉移4個預冷離心瓶中（約250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分鐘。5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預冷所有轉頭。6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol...
[器材和試劑]●用于細菌培養的96孔圓底微量滴定板（Nunc，目錄號62162）●含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培養基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實驗方案13．10）●噬菌體樣品[方法]1．用96孔無菌轉移設備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉移至1個每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的無菌96孔微量滴定板中。2...
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